1、cd276(recombinant cluster of differentiation 276)，又称b7-h3，是i型跨膜糖蛋白，分子量为45-66kda，其与b7-h1(pd-l1)有相似的分子结构，是b7-cd28家族重要的免疫检查点分子。cd276主要以膜蛋白和可溶形式存在，其中，可溶形式由膜蛋白经金属蛋白酶剪切而来。此外，在外泌体和其他胞外小泡中也发现了cd276蛋白。cd276在免疫系统中可能发挥共刺激和共抑制的双重作用：一方面，其具有对cd4+和cd8+t细胞的共刺激作用，作为一种共刺激分子，cd276信号诱导细胞免疫，促进细胞因子ifn-γ、il-8、tnf-α等的分泌，增强cd8+t细胞的细胞毒作用；另一方面，其能抑制treg细胞，从而使肿瘤逃逸免疫反应，其机制可能与t细胞表面受体调节基因转录的nfat、nfκb和ap-1因子三个主要信号通路相关。已有大量研究证实cd276在多种类型的癌症中广泛表达，其与肿瘤不良预后的相关性也被确认。目前cd276抗体的临床应用研究主要有针对肿瘤的抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugates，adc)、抗体介导的细胞毒(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，adcc)药物、双特异性及三特异性抗体、嵌合抗原受体t细胞(chimericantigen receptor t，car-t)治疗等。

　　2、重链抗体是1989年于骆驼科动物体内发现的一类缺失轻链和重链恒定区1(constant domain of heavy chain，ch1)的一类新型抗体。纳米抗体克隆自重链抗体的重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody，vhh)，晶体直径仅2.5nm，分子量12-15kda，是目前已知的分子量最小的抗体。纳米抗体与传统抗体相比优点是：1、纳米抗体具有更长的第三抗原互补决定区，维持了与正常双链抗体相似的抗原结合能力且能够更好地和抗原表位结合。2、纳米抗体内部都会存在环间二硫键，在高温和更高浓度的有机溶剂中稳定性更强。3、纳米抗体的第二骨架区含有四个保守的亲水性氨基酸突变，导致其具有亲水性，不易发生聚集，影响抗原识别。4、纳米抗体体积小，能够更好地渗透致密的肿瘤组织，应用于实体瘤治疗。5、纳米抗体只有重链可变区，在多个纳米抗体联合使用时，不会发生重链和轻链的交叉反应，影响抗体治疗效果。6、纳米抗体来自骆驼科，与人源抗体相似度极高，免疫原性低，在治疗时不会产生中和抗体。

　　3、目前市面上报道的针对cd276的抗体绝大部分都是由重链可变区(variabledomain of heavy chain of heavy chain antibody，vhh)和轻链可变区组成的单链抗体(single chain fragment variable，scfv)。scfv抗体大小几乎是vhh抗体的两倍，并且在scfv中，fr2中的四个残基形成疏水界面，这个疏水区虽然促进了vh-vl的连接，但是降低了scfv的溶解度，导致它们有很高的聚集倾向，相比vhh抗体，scfv抗体不容易溶解，可能会影响对抗原的识别。scfv的另一个重大缺点是它们大部分来源于啮齿类动物，因为杂交瘤技术只在小鼠和大鼠身上得到很好的发展。小鼠vl和vh与人类相应区域的序列同源性分别只有53％和51％，而vhh抗体与人类vh(vh3基因家族)显示出很高的序列相似性，约75-90％的同源性，因此vhh抗体的人性化程度更高，免疫原性更低。鼠源scfv抗体即使在人源化之后，其可变区仍能引起抗独特型反应，不利于免疫治疗。

　　1、基于纳米抗体的优势，本发明成功构建了人cd276胞外段蛋白免疫的羊驼噬菌体抗体库，并从中筛选出了2条新的抗cd276的纳米抗体的vhh序列。我们实验发现该纳米抗体既可以做细胞流式又可以做组织的免疫组化来检测人cd276抗原，因此具有检测cd276抗原的应用前景；同时，该纳米抗体序列可制备成嵌合抗原受体t细胞(car-t)，并可以轻松又有效地杀伤cd276阳性的肿瘤细胞，因此具有应用于靶向cd276阳性细胞的免疫治疗方面的前景。

　　2、本发明所涉及的术语“嵌合抗原受体”，是指一种人造受体，经过基因工程改造，赋予免疫细胞(如t淋巴细胞)靶向特定抗原的新能力。这些受体是嵌合的，因为它们将抗体中特异性识别抗原的结构域和t细胞激活功能域结合到一个受体中。

　　3、本发明所涉及的术语“重链cdr”，即，重链的互补决定区，是指抗体重链可变区的核心保守结构，是决定抗体结合抗原的关键区域，包括cdr1、cdr2和cdr3。

　　4、本发明所涉及的术语“框架区fr”，是vhh抗体中除cdr区外的序列。

　　5、本发明的一个目的是，提供一种抗cd276的纳米抗体，所述抗cd276的纳米抗体包括互补决定区cdr和框架区fr；

　　15、进一步地，所述抗cd276的纳米抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其组合。

　　16、本发明的另一个目的是，提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述抗cd276的纳米抗体。

　　18、本发明的另一个目的是，提供一种载体，所述载体包括上述抗cd276的纳米抗体。

　　20、本发明的另一个目的是，提供所述载体在抗原检测、吸附抗原试剂和免疫治疗中的应用。

　　23、噬菌体展示技术是最常用的纳米抗体生产方法，通过基因工程从天然、免疫或合成抗体库中获取cdna。将该dna插入到噬菌体外壳蛋白的合适位置，与外壳蛋白形成融合蛋白一同表达到噬菌体表面，然后筛选能与抗原结合的蛋白。采用免疫抗体库筛选抗体，特异性高且更容易获得高亲和力抗体。

　　24、因此，本发明基于发明人团队构建的人cd276蛋白胞外段免疫的羊驼噬菌体抗体展示库筛选抗cd276的纳米抗体，可较好地应用于针对cd276阳性肿瘤细胞的免疫治疗。

　　25、本发明发现了两条全新的抗人cd276纳米抗体序列，该序列与其他纳米抗体序列完全不同，其可用于cd276抗原的识别、cd276阳性细胞的内吞、car-t细胞的构建和对cd276阳性细胞的杀伤。

　　27、本发明公开了一种抗cd276的纳米抗体，所述抗cd276的纳米抗体包括重链cdr1-cdr3。本发明首先表达纯化cd276胞外段多肽，并使其具有免疫原性，然后将cd276胞外段多肽偶联在酶标板上，展示该蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选cd276胞外段免疫的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了cd276特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株；我们的前期实验发现本发明方法筛选得到的cd276纳米抗体具有与cd276抗原免疫反应的特性，且特异性好、亲和力高，可应用于制备cd276检测试剂或抗肿瘤药物等，例如本发明提供的抗人cd276纳米抗体可当作car的抗原识别结构域进而进行car-t细胞的构建，其对表达cd276抗原的多种肿瘤细胞系具有非常明显杀伤作用；本发明提供的抗人cd276纳米抗体可被cd276表达阳性的细胞内吞；另外，本发明提供的抗人cd276纳米抗体能够适用于检测肿瘤组织中cd276的表达。

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